血清分离实验哪能少的了它

发布时间：2021/3/31 18:30:55      浏览:

　　离心机被广泛应用于血清分离实验。

　　血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

　　血液完全凝固和离心条件是至关重要的两个环节,离心要求采用水平式离心机。具体操作步骤是:采血后立即轻轻倒转采血试管4~5次混匀标本,等待标本充分凝固需要放置30min,离心半径200px,离心机离心速度维持在3500~4000r/min离心10min。血清与血凝块完全被分离胶分离,血清标本可直接上机检测或转移至仪器配套试杯中。具备这个条件才能制备出高品质血清标本，说明分离胶效果好。

　　盐析后蛋白质沉淀经水溶后，特点是保持蛋白质生物学活性，因此，盐析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。除盐析法，有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋白质分离的常用方法。

　　实验器材和试剂

　　1．器材：10ml具塞刻度试管、离心机、离心管、小试管、5ml吸管、滴管2支、培养皿3套、醋酸纤维薄膜、点样器、电泳槽、电泳仪、1.0×20cm层析柱。

　　2．试剂：

　　(1) 葡聚糖凝胶Sephadex G-25：称10g SephadexG-25，加200ml 0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

　　(2) 生理盐水：称取分析纯NaCl  0.89g，蒸馏水稀释至100ml。

　　(3) 饱和硫酸铵溶液：25℃时称取(NH４)２SO4约767g,溶解至1000ml蒸馏水中，至不能完全溶解为止，即为饱和硫酸铵溶液。

　　(4) 巴比妥缓冲液(pH 8.6)：称取巴比妥钠15.458g．巴比妥2.768g，蒸馏水定容至1000m1。

　　(5) 氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g,加入100ml漂洗液不断振摇,直到完全溶解。

　　(6) 漂洗液：取95％乙醇450ml，冰醋酸100m1，混匀后，用蒸馏水稀释到l000ml。

　　盐析沉淀蛋白质：

　　取10 m1具塞刻度试管1支，加入血清溶液 2.5ml，缓慢加进等量饱和(NH4)2SO4溶液，充分摇匀，见有沉淀析出，静置10min，用双层滤纸过滤，弃去沉淀，取滤液。

　　蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：水化膜和表面电荷。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法是以中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而析出。不同的蛋白质沉淀需要的中性盐浓度不同，在不同盐浓度下，蛋白质溶解度不同。球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而请蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，此种盐析法称分段盐析。

　　此次实验注意事项：

　　1、只有经过严格培训的人员才能进行离心机操作。

　　2、操作时应戴手套以及眼睛和黏膜的保护装置。

　　3、规范的实验操作技术可以避免或尽量减少喷溅和气溶胶的产生。血液和血清应当小心吸取，而不能倾倒。严禁用口吸液。

　　4、移液管使用后应完全浸入适当的消毒液中。移液管应在消毒液中浸泡适当的时间，然后再丢弃或灭菌清洗后重复使用。

　　5、带有血凝块等的废弃标本管，在加盖后应当放在适当的防漏容器内高压灭菌和／或焚烧。

　　6、应备有适当的消毒剂来清洗喷溅和溢出标本。