休止细胞制备少不了离心机

发布时间：2022/1/7 16:12:47      浏览:

　　休止细胞制备少不了离心机。

　　休止细胞反应又称静息细胞,把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种险系，其有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长及醇合成的抑制。

　　培养基的制备及灭菌：

　　按实验材料中的培养基种类和数量配置相应培养基，进行灭菌。

　　菌种活化和扩大化培养

　　将E.coli cVcc249保藏菌种转接到试管完全固体培养基斜面,37℃下培养18~24h.

　　选取长势良好的活化菌种转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养16~18h。

　　休止细胞的制备将三角瓶中的菌体倒入离心管中，4000rpm离心机离心15min，收集沉淀。

　　85%生理盐水洗涤沉淀三次，每次4000rpm离心机离心15min。

　　用pH 7.0的磷酸缓冲液（PBS)20mL（用量根据使菌体数量而定）制备菌悬液，将制成的菌悬液放入4℃冰箱培养72hr，以降低内呼吸，制得休止细胞。

　　底物的配制：

　　分别配制浓度为0.1M的四种底物:乙酸钠、琥珀酸钠、α -酮戊二酸钠和柠檬酸钠。按照需要进行不同浓度梯度的稀释。

　　酶与底物反应：

　　在5mL的离心管中，加入0.4ml的休止细胞和0.4ml底物，37℃恒温30min;加入40ul噻唑盐，振荡混匀，在37℃下反应.2hr;反应完后，再离心管中加入1.5mL的二甲亚矾，混匀振荡，并在37℃恒温箱中保温 30min;加入蒸馏水1.5ml。

　　测定OD510值：

　　按照分光光度计的使用说明，测定各个样品的ODs1o值，并做好实验记录。

　　整个实验过程中一定要无菌操作，尤其是活化菌株时，因为所用的培养基为完全培养基，一般的微生物也能生长，为确保所测得的脱氢酶活性是来自于保藏菌种的，所以第一步活化菌种时一定要确保无菌操作。

　　嚷唑盐必须避光保存，因其见光易分解。另外，由于噻唑盐和二甲基亚矾都有毒性，再加入这两种试剂时，需戴手套进行操作。

　　休止细胞反应实验操作在洗涤细胞时，每次悬浮务必充分，否则容易造成洗涤不干净，导致有残存的营养物质，导致休止细胞的质量不好。

　　在用分光光度计测量其OD值时，由于本实验中所用的分光光度计适合的测量范围在0.2~0.7中，在测量前需检测下样品的OD值是否在这个范围内，如果过高，则加适量PBS稀释。另外，在测量前，样品需充分混匀，且动作要快，以免甲瓒又结晶出来，影响测量的结果。空白对照为蒸馏水。