菌体或者细胞裂解法中哪些需要用到离心机

发布时间：2021/9/22 17:09:30      浏览:

　　离心机在菌体或者细胞裂解法中都会应用到。

　　今天就例举几个常见的方法，进行简单得汇总：

　　一、反复冻融法：

　　1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

　　2、至少3次以上冻溶。

　　3、IFCC推荐法：

　　收集细胞悬液，将离心机设置4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

　　4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻。

　　二、超声波处理法

　　1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

　　2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

　　3、100ml菌液用离心机离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W 40％功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。

　　4、综合冻融和超声的方法：

　　1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。

　　将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。

　　可选择：4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。

　　三、裂解液处理法：

　　1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

　　2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。

　　3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。

　　4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。

　　5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？

　　6、将1ml菌通过离心机离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。

　　7、检测蛋白诱导：

　　从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。

　　《分子克隆》P826

　　8、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液（100℃加热）。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

　　2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/v）DTT，8％SDS，0.002％（w/v）溴酚蓝，40％甘油。

　　Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

　　9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。

　　10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30－60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。

　　11、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。

　　12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。

　　13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。

　　推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 ?g/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 ?g/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。

　　14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3VO4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine（inhibitor of trypsin）。

　　15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清，用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬，冰上放置。

　　6000rpm×10min离心培养物。弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃，9000g×30min离心。取上清。

　　裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml溶菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。

　　Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol

　　16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 ?g/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%)，然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA?琼脂糖柱层析。

　　以上就是关于离心机在一些常见实验中得应用，如果您还想了解更多有关应用知识，可以来上海卢湘仪离心机仪器有限公司，与我司相关技术人员交流探讨。