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大容量离心机分离血细胞的技术

发布时间:2012/1/8 23:34:20      浏览:

(一)材料与试剂1.抗凝剂(1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固。常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U~126U/mg。(2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂。用生理盐水配制成4%的溶液备用。(3)阿氏液(Alsever液),配方如下:枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)0.80g 枸橼酸 0.0325g    葡萄糖 2.05g    氯化钠 0.42g    H2O加至100.00ml混匀溶解后,114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用。阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液。2.针头根据不同动物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒。3.采血容器注射器或三角瓶等。4.采血动物。
(二)操作方法1.采血法各种动物采血方法不一。马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血,猪从颈静脉、前腔静脉或耳静脉采血,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。2.抗凝采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定。最常用的方法如下:(1)肝素抗凝:采血时,使每ml血液含15U~20U肝素即可。计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血时,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀。对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝。(2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4%溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内。采血,并不断摇动采血容器,使之混匀。(3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用。采血过程中,边采边摇采血瓶,以使小玻璃珠在血液中滚动,以机械地除去纤维蛋白,使血液不能凝固。本法虽较麻烦,但对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂。(4)阿氏液采血:以阿氏液和采血量以1︰1比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀。用阿氏液采血,除了抗凝外,多用于红细胞的保存。一般在4℃条件下,阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变。
红细胞的分离技术
(一)材料与试剂1.肝素等抗凝剂2.3%明胶液取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存。临用时,37℃预热10min。3.阿氏液
(二)操作方法1.采血抗凝,即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计。2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理。如计算红细胞,可直接稀释计数。如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次。3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可。
淋巴细胞的分离技术

(一)材料与试剂    1.淋巴细胞分层液有两种:(1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用时,用蒸馏水配制9%溶液。泛影葡胺溶液Meglumini diatrizoici,商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制:9%聚蔗糖液 24份       33.9%泛影葡胺液 10份混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存。一般可保存3个月。如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算:式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液  34%泛影葡胺液10份    60%右旋糖酐液12.5份混合,即为比重1.07~1.09的分层液。分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用。2.3%的明胶液称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min。3.Hank’s液。

(二)操作方法1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆。如是牛、羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆。2.2 000r/min离心10min,弃上清。3.沉淀用Hank’s液混悬后,再2 000r/min离心10min。4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群,包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可。6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层。7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中。8.以Hank’s液洗涤、离心,最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。

(三)注意事项1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离。3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞。

T淋巴细胞的分离技术

(一)原理混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T细胞群的有效方法。(二)材料及试剂1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。2.烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。3.装填尼龙毛柱,一次性注射器。4.取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。

(三)操作方法1.尼龙毛的清洗与干燥(1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。(2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干。(3)重复(1)、(2)步骤6次。(4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2~3天后,贮藏在带盖的方盘内。2.装尼龙毛柱(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。(2)将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积。(3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。3.细胞分离(1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门。(2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml。(3)将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱。盖上注射器,37℃温育45min至1h。(4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中。(5)离心,即获所需的T淋巴细胞。(6)关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。(四)注意事项1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系。2.此法的T淋巴细胞的回收率约20%~30%。3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗。

单核细胞分离技术

(一)铁粉吸附法1.材料及试剂(1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60µm(Goodfellow Metals)。(2)强磁铁(马蹄形)。(3)一块小棒状磁铁(约1cm长)。(4)毛细吸管等。2.操作方法(1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时,用强磁铁吸住铁粉。(2)用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后立即轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用。(3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml~5ml,细胞总数为8×107个/瓶)。37℃温育45min,中间不时晃动,使铁粉悬浮起来。(4)加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。(5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集。(6)在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液,用力振摇后,以强磁铁吸附,几分钟后,倒出液体。(7)2 000r/min离心液体,管底即为单核细胞。

(二)玻璃板吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃30 min~40min,用毛细吸管轻轻吸取悬液,即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液。