离心机在休止细胞反应实验中的运用

发布时间：2021/12/17 10:49:31      浏览:

　　休止细胞反应实验的顺利进行需要用到离心机。

　　因为在细胞制备阶段细菌收集过程中离心分离提取细胞。

　　休止细胞又称静息细胞,把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强，可以提高底物转化率，不易染杂菌，可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。

　　休止细胞的制备：

　　(1)菌株的活化

　　用接种环将实验所需的E. coli CVCC 249接种到已灭菌的固体斜面培养基上，37 ℃恒温箱培养18—24 h。

　　(2)菌株的获得

　　用接种环在斜面培养基上刮取适量菌转接至液体三角瓶中，恒温振荡培养箱37 ℃振荡培养至OD > 1.（大约1.4左右）。

　　(3)细菌的收集

　　将培养好的细胞菌液放入离心管中，离心机4500 rpm 离心收集细胞，弃去上清培养液，用生理盐水洗涤，洗去培养液，之后离心机4500 rpm离心收集细胞，重复洗涤三次至上清液透明，弃去上清液。

　　(4)菌悬液的制备

　　将离心后的细胞用pH 为7.0 的磷酸缓冲液定量至25 mL，吹悬混匀，为以后实验使用。

　　(5)休止细胞的制备

　　菌悬液放置在4 ℃条件下放置72 h 后，在37 ℃培养4—8 h，休止细胞制备完成，放在4 ℃冰箱中备用。

　　脱氢酶活性的测定：

　　(1) 在5 mL的离心管中加入1 mL反应底物，并根据底物设置不同的浓度（同一浓度不同底物对细胞脱氢酶活性影响，如表1所示。不同稀释度的各种底物对细菌脱氢酶降活性影响，我们做了三种底物的实验，分别是乙酸钠，琥珀酸钠和柠檬酸钠，如表2，表3和表4所示）。

　　(2) 加入制备的休止细胞0.4 mL，用等体积的5%甲醛处理30 min灭活的细胞悬液作为对照。在加入细胞之前一定注意将休止细胞摇匀后再加。

　　(3) 加入MTT 40 μL ，震荡摇匀，此时的溶液应呈黄色，恒温培养箱中37 ℃避光保温2 h。

　　(4) 加入二甲基亚砜1.3 mL，震荡混匀后，37 ℃保温30min ，此时溶液呈深蓝紫色。

　　(5) 加入PBS （pH 7.0）1.5 mL，振荡混匀。

　　(6) 722分光光度计测510 nm的OD ，每个样品浓度至少要进行三次实验，变异系数(coefficient of variation ，CV) 小于5%。

　　酶活性是指酶催化一定化学反应的能力。任何一个酶都有催化一定底物进行特定反应的能力，但是酶的催化能力的测定实际上只能通过测定酶催化反应速度来实现。酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。而酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。另外，在研究酶促反应时，底物一般是过量的，因此一般测定产物的增加量较合适些。由于酶催化反应速度受温度、pH、离子强度及底物等诸多因素的影响，我们所谓的酶活性都是只在特定的系统和条件下测到的反应速度，因此在测定酶活性时，一定要注明这些特定的条件。即使同样的酶，甚至用同样的测定方法和同样的单位定义，由于条件稍有不同，也会使测到的酶活性难以比较。因此，要比较各篇文献报道或者不同牌号制剂的某种酶活性时，必须注意它们的单位定义和测定系统及条件，千万不能盲目比较。

　　与酶活性相关的另一个概念是“比活”，食指单位重量的蛋白质中所含的某种酶的催化活性，是纯度量度，单位为u/mg。比活越高则酶越纯。